Questa popolare tecnica di gene-editing è in grado di fornire un resoconto passo passo di come un embrione di una singola cellula possa diventare un animale da un miliardo di cellule. L’acronimo CRISPR può essere tradotto come: brevi ripetizioni palindrome raggruppate e separate a intervalli regolari.

Come ogni altro animale, il verme nematode C. elegans inizia la sua vita come una singola cellula fertilizzata. Col tempo avvengono le successive divisioni cellulari e il verme diventa adulto, quell’originaria singola cellula diventa 959 0 1031 cellule, in base al sesso dell’animale. La parte interessante è che il numero delle cellule che compongono il verme non cambia tra un individuo ad un altro, ma rimane costante. Cosa ancora più interessante è che noi sappiamo esattamente quale sia il progenitore di ogni cellula, grazie ad uno studioso John Sulston, che ha passato ben 18 mesi della sua vita a disegnare a mano questi vermi in camera oscura.

Sulston ha lavorato da solo, in silenzio, stando al microscopio otto ore al giorno. Studiando e disegnando vermi di varie età, ha trovato predecessori e discendenti di ogni cellula. Questo fu un monumentale pezzo di scienza. Lo scienziato mappò l’intera storia di un individuo, una sorta di albero genealogico ma applicato ad un singolo corpo. Più tardi, mentre accettava il Premio Nobel, lui stesso dichiarò: “ Abbiamo l’intera storia di un verme, dalla singola cellula fertilizzata all’adulto.”

Studiare questo verme, il C. elegans, fu un vero colpo di genio per vari motivi: è piccolo, e quindi ha poche cellule; inoltre si sviluppa nello stesso identico modo ogni volta in ogni essere, quindi ogni cellula ha un destino invariato. Di contro però mappare le linee cellulari su un animale di dimensioni maggiori ( e quindi più cellule) tipo un topo o una mosca, è assolutamente più arduo. Negli anni 2000 Jay Shendure ha iniziato a pensare ad un modo per poter risolvere questo dilemma. “ Ho lavorato per sei mesi, e dopo il mio primo incontro in laboratorio per presentare il mio progetto, un post dottorato mi bloccò. Mi disse che la mia idea avrebbe richiesto alcune decadi per essere messa in atto” ricorda Shendure. “Cambiai progetto, ma questo è sempre rimasto in un angolo della mia mente.” Sedici anni dopo, Sheldure è un professore della University of Washington e ha finalmente creato un modo per mappare le linee cellulari in animali di dimensioni più grandi di un semplice vermetto. In modo creativo ha riproposto lo strumento più alla mode nella biologia molecolare la tecnica di gene-editing chiamata CRISPR.

La CRISPR comprende due componenti: un enzima che taglia a fette il DNA, e una molecola guida che può distribuire con precisione l’enzima di taglio sul bersaglio scelto. La tecnica di Shendure comprende l’inserimento di una fila consecutiva di siti bersaglio in un angolo tranquillo del DNA di una cellula, creando una sequenza che funge da barcode. Una volta che il DNA è stato tagliato, e poi riparato, possono essere aggiunti nuovi nucleotidi oppure se ne possono eliminare alcuni già esistenti. Una volta che la cellula si divide, passa queste modifiche ( editing ) del barcode alle cellule figlie, le quali vengono anch’esse tagliate, riparate ed editate e passate allo stadio successivo. E così via, ad ogni passaggio il barcode si modifica un po’ di più, in modo irreversibile e casuale. Ogni cellula eredita ritocchi accumulati dalla sua progenitrice, mentre trasmette i suoi nuovi cambiamenti alle sue discendenti. Comparando poi i barcode di tutte le cellule si può quindi ricostruire l’intera “storia familiare” della cellula. Quello che Sulston aveva fatto ad occhio ( o meglio al microscopio), Shendure e il suo team l’hanno fatto sequenziando il DNA. La tecnica, in breve GESTALT, è in pratica un editing genomico di bersagli sintetici per il tracciamento di una stirpe cellulare.

La GESTALT è già stata utilizzata da altri gruppi di ricerca applicandola appunto ad animali più complessi, come ad esempio quello di James Gagnon della Harvard University, che ha creato una linea di pesce zebra geneticamente modificata inserendo barcodes con dieci siti bersaglio CRISPR. Quando i pesci erano solo embrioni ad una singola cellula fertilizzata, sono stati iniettati con l’enzima di taglio e le sue “guide”. Non appena gli animali hanno iniziato a crescere, la GESTALT ha iniziato a lavorare, producendo centinaia di barcode unici. Gagnon ha potuto quindi leggerli nei pesci adulti. In ogni organo in cui andava a guardare, trovava che la gran parte delle cellule derivava da un pugno di progenitori.

L’unico neo della tecnica è che permette solo di rivelare le linee di discendenza tra le cellule del pesce, senza però mostrare dove queste cellule sono presenti nell’animale. L’idea per ovviare a questa mancanza sarebbe accoppiare i barcode con molecole fluorescenti, così da permettere alle linee cellulari di poter essere effettivamente viste nel pesce in crescita. Anche perché senza questa informazione, neanche la GESTALT può riprodurre l’intero albero genealogico che Sulston aveva abilmente e pazientemente disegnato per il C. elegans. Per ora quindi la tecnica è arenata a risultati su pesci nei primi periodi di vita, ma il team è propenso a riuscire a tracciare l’albero genealogico cellulare anche negli esemplari adulti. Inoltre sono intenzionati a provare la GESTALT anche su altri comuni animali da laboratorio, come topi e moscerini. Ovviamente la tecnica non potrà essere applicata all’uomo, per evidenti ostacoli etici.

 

Francesca Romana Piccioni